Pengklonan dan Pengekspresan Gen Xilanase Termostabil daripada Bacllus Coagulans St-6 ke dalam Escherichia Coli HB101 - Adnan, Norwati (1996)

(untitled)
Bacillus coagulans ST-6 merupakan bakteria termofilik yang berupaya mengekspreskan aktiviti xilanase termostabil. Gen xilanase tersebut telah beIjaya diklonkan dengan menyelitkan serpihan DNA daripada genom B. coagu/ans ST-6 yang telah dipotong oleh enzim Bam HI ke dalam tapak Bam HI yang terdapat di dalam vektor pBR322. Seterusnya plasmid rekombinan tersebut ditransformasikan ke dalam Eshcerichia coli HB101 dan koloni yang mengandungi gen xilanase dipilih dengan menggunakan agar media bercampur substrat RBB-xilan. Daripada 3,270 transforman yang terpilih, hanya dua koloni didapati mengekspreskan aktiviti xilanase iaitu dengan kewujudan zon cerah di sekelilingnya. Penyaringan seterusnya mendapati hanya satu koloni sahaja yang stabil untuk kajian selanjutnya. Plasmid rekombinan tersebut dinamakan sebagai pBNX. Pemotongan plasmid pBNX dengan enzim Bam HI mendapati DNA selitan tersebut bersaiz 2.56 kb. Kajian selanjutnya menunjukkan ia mengandungi tapak pemotongan bagi enzim Hind 111, Sal 1 dan &0 RV tetapi tiada tapak bagi enzim Eco R1, Pst 1, Kpn 1 dan Sac 1. Keputusan daripada penghibridan dengan prob DNA selitan melalui kaedah pemblotan Southern telah mengesahkan DNA selitan bagi plasmid rekombinan (pBNX) tersebut berasal daripada B. coagu/ans ST-6. Enzim xilanase kasar yang dihasilkan oleh klon tersebut menunjukkan ciri-ciri yang sarna dengan enzim xilanase kasar daripada B. coagu/ans ST-6, di mana suhu dan pH optimumnya adalah SOoC dan 7.2. Enzim xilanase daripada E. coli (PBNX) dan B. coagulans ST-6 juga stabil pada suhu 60˚C. Pengsubklonan DNA selitan dalam plasmid pBNX ke dalam pUC19 dan pUC18 juga telah dilakukan dan kedua-duanya mengekspreskan aktiviti xilanase. Plasmid kedua-duanya dikenali sebagai pBNXl dan pBNX2. Tindakbalas dengan enzim pembatas Sal 1 menunjukkan cara kemasukan DNA selitan dalam kedua-dua subklon mempunyai orientasi yang sama.