Penggunaan Kaedah 2d-Page Untuk Kajian Pengekspresan Protein Semasa Embriogenesis Puntius gonionotus - Ahmat @ Amiruddin, Suhaida (2004)
Pengekspresan protein dapat dikesan dengan menggunakan elektroforesis 2-dimensi (2-DE) dan hasilnya adalah suatu elektroferogram. Elektroferogram ini kemudiannya perlu diwarnakan bagi menghasilkan suatu peta protein. Peta protein yang terhasil ini merupakan kajian kuantitatif bagi memerhati perubahan protein yang diekspreskan oleh sesuatu tisu, sel mahupun bendalir badan. Kajian ini dapat mengenal pasti protein yang hadir atau juga yang hilang ketika proses embriogenesis berlaku . Dalam kerja selidik ini, pengekspresan protein semasa embriogenesis Puntius gonionotus telah menunjukan protein tersebut mengalami perubahan semasa melalui tujuh fasa perkembangan yang dikaji. Matlamat utama penyelidikan ini adalah bertujuan untuk memajukan kaedah 2-DE bagi mengkaji perubahan protein yang berlaku semasa embriogenesis. Bagi memajukan kaedah ini beberapa kerja preliminari dijalankan terlebih dahulu, iaitu pemilihan penimbal lisis, peratusan gel dan juga pewarnaan gel yang sesuai. Elektroforesis dua–dimensi (2-DE) merupakan suatu kaedah yang digunakan dalam mengkaji ekspresi protein secara keseluruhan dalam sesuatu sampel. Melalui kaedah ini, campuran protein kompleks dapat dipisahkan dalam gel poliakrilamida berdasarkan cas dan berat molekul protein tersebut. Pemilihan penimbal lisis yang sesuai perlu dilakukan berikutan tiada satu pun kaedah penyediaan sampel yang dapat digunakan secara universal bagi mengekstrak semua jenis protein yang terkandung dalam setiap sampel yang dikaji. Oleh yang demikian, bagi melakukan perbandingan, beberapa jenis penimbal lisis berdasarkan kepada kaedah Görg et al. (2000) dan Kanaya et al. (2000) samada yang vi asal dan juga yang telah diubahsuai serta penimbal Triton X-100 telah digunakan. Seterusnya ekstrak-ekstrak protein tersebut dinilai melalui elektroforesis 1-dimensi. Penimbal lisis Kanaya et al. (2000) yang telah diubahsuai adalah didapati larutan pengekstrak yang paling berkesan bagi melarutkan protein telur Puntius gonionotus. Penggunaan penimbal ini dapat menghasilkan jumlah jalur protein yang paling banyak dalam pemisahan elektroforesis 1-dimensi. Penimbal lisis ini seterusnya telah digunakan untuk mengekstrak protein dari beberapa fasa embriogenesis Puntius gonionotus. Seterusnya, penentuan peratusan gel yang sesuai pula telah dilakukan dengan menggunakan empat jenis peratusan gel yang berbeza. Ia amat penting dalam memastikan julat pengasingan protein yang dikaji adalah luas. Didapati SDS-PAGE yang mempunyai peratusan gel 12% telah dipilih berikutan ia berjaya mengasingkan protein dalam julat yang luas. Langkah terakhir bagi memajukan kaedah ini, pemilihan kaedah pewarnaan gel pada elektroferogram yang dihasilkan dilakukan. Ia dilakukan untuk mengesan protein yang telah dipisahkan. ’Coomassie Brilliant Blue R-250’ dan pewarnaan ‘silver’ telah dipilih untuk dilakukan perbandingan. Peta protein merupakan hasil akhir yang diperolehi dan ia hanya berjaya diwarnakan melalui pewarnaan ‘silver’. Melalui peta protein yang diperolehi didapati, degradasi dan sintesis protein berlaku sepanjang proses embriogenesis. Terdapat protein baru dihasilkan bagi setiap fasa embriogenesis. Namun begitu, ada juga protein yang tidak dapat dikesan setelah melalui fasa perkembangan embrio tersebut. Boleh dikatakan kebanyakan protein yang diperolehi adalah bersifat basik dengan julat pH diantara pH 7.5 - pH 10